猛戳:單克隆抗體制備過程中的兩次篩選簡介

閱讀次數(shù)：642 發(fā)布時間：2018/3/26 9:25:23

科研新手們，您可知道單克隆抗體制備過程中，總共有兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，兩次篩選的原理和方法是不相同的呢?關(guān)注上海恒遠(yuǎn)生物，即可掌握更多科研小知識哦！言歸正傳，接下來恒遠(yuǎn)小編就帶您了解單克隆抗體制備過程中的兩次篩選簡介！

第一次篩選：
細(xì)胞融合后，雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)是第一次篩選的關(guān)鍵。普遍采用的HAT選擇性培養(yǎng)液是在普通的動物細(xì)胞培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依據(jù)是細(xì)胞中的DNA合成有兩條途徑：
一條途徑是生物合成途徑（“D途徑”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA分子的合成提供原料。在此合成過程中，葉酸作為重要的輔酶參與這一過程，而HAT培養(yǎng)液中氨基喋呤是一種葉酸的拮抗物，可以阻斷DNA合成的“D途徑”。
另一條途徑是應(yīng)急途徑或補(bǔ)救途徑（“S途徑”），它是利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應(yīng)的核苷酸，兩種酶缺一不可。因此，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的效應(yīng)B細(xì)胞和兩個效應(yīng)B細(xì)胞融合的“D途徑”被氨基喋呤阻斷，雖“S途徑”正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液中增殖的能力，一般10d左右會死亡。
對于骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞而言，由于通常采用的骨髓瘤細(xì)胞是次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT）細(xì)胞，因此自身沒有“S途徑”，且“D途徑”又被氨基喋呤阻斷，所以在HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤細(xì)胞與效應(yīng)B細(xì)胞相互融合形成的雜交瘤細(xì)胞，既具有效應(yīng)B細(xì)胞的“S途徑”，又具有骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液中長期增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來，并不斷增殖。

第二次篩選：
在實(shí)際免疫過程中，由于采用連續(xù)注射抗原的方法，且一種抗原決定簇刺激機(jī)體形成相對應(yīng)的一種效應(yīng)B淋巴細(xì)胞，因此，從小鼠脾臟中取出的效應(yīng)B淋巴細(xì)胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選的雜交瘤細(xì)胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細(xì)胞群中篩選出能產(chǎn)生針對某一預(yù)定抗原快定簇的特異性雜交瘤細(xì)胞。通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每一孔含一個或幾個雜交瘤細(xì)胞（理論上30%的孔中細(xì)胞數(shù)為0時，才能保證有些孔中是單個細(xì)胞），再由這些單細(xì)胞克隆生長，最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。