閱讀次數(shù)：3225 發(fā)布時間：2020/9/21 11:46:18
蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。WB實驗作為科研研究中實驗其中一種方法，卻蘊含了很多知識，可謂是小實驗里卻有大文章。針對WB實驗經(jīng)常遇到的一些問題，恒遠生物技術(shù)專員總結(jié)出了應(yīng)對的一系列“5點”注意事前及建議，希望能幫助到您！
實驗的5點注意事項：
1.陽性對照對裂解物用來表明實驗室有效并且是正確的，及可證明目標蛋白不在樣本表達。
2.跑在樣品旁邊的分子量標準能測定蛋白分子量的大小并且能監(jiān)測電泳的進展。
3.避免手指直接接觸膜，應(yīng)使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑。
4.確認裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，邊緣太大會導致在進行轉(zhuǎn)膜時電流不能通過膜。
5.過度曝光的膠片不適合用于分析，因為不能判定相對蛋白量。
解決無信號的5點建議：
1.二抗需和一抗宿主的物種相同（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體）。原因： 一抗和二抗不匹配。
2.參照說明書，設(shè)置陽性對照。原因：一抗不識別檢測物種蛋白。
3.每泳道蛋白上樣量不低于20~30μg，設(shè)置陽性對照。原因：抗原量不足。
4.使用可逆染色劑如麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果，檢測轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF膜預(yù)先浸在甲醇中。原因：轉(zhuǎn)膜不充分。
5. 使用含0.5%脫脂奶粉或更換封閉劑，減少封閉時間。原因：過度封閉使目標蛋白不能顯色。
解決抗體問題的5點建議：
1. 一抗，二抗的比例比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。
2. 做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，對二抗無要求，要看您實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。
3.不同抗體，即使是同一公司的抗體，其最佳的抗體稀釋度也是不一樣的，需要您實驗摸索。
4. 如果您所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）
5.抗體工作溶液一般不主張儲存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。
解決背景高的5點建議：
1.稀釋抗體至合適濃度，以更高稀釋度抗體孵育更長時間。
2.抗體孵育溫度過高： 4℃孵育。
3.膜干燥：保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。
4.封閉不充分： 延長封閉時間， 考慮更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）。
5.未結(jié)合蛋白洗滌不充分： 增加洗滌次數(shù)。
解決多條帶現(xiàn)象的5點建議：
1.查閱文獻。原因：體內(nèi)表達的蛋白具有多種修飾形式，如乙酰化，甲基化，糖基化等。
2.在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。原因：蛋白樣本降解（蛋白質(zhì)分子量降低）。
3.降低抗體濃度或者抗體孵育時間。原因：一抗?jié)舛冗^高，高濃度時常出現(xiàn)多蛋白條帶。
4.使用原始未傳代的細胞株，和現(xiàn)在的細胞株一起做平行對照試驗。原因： 細胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達不同。
5.降低抗體濃度，增加二抗對照（不加一抗）。原因：二抗?jié)舛冗^高，高濃度產(chǎn)生非特異結(jié)合
解決其他問題的5點建議：
1.轉(zhuǎn)膜時膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均。
2.背景有黑色斑點：抗體結(jié)合了封閉劑（過濾封閉劑）。
3.“微笑”條帶：遷移過快或電泳溫度過高，改變了pH值和遷移速度（降低遷移速度或低溫電泳）。
4.抗體量不足：確保在孵育時抗體充分浸沒膜。
5.目的條帶染色過低/過高：分離不徹底。
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