閱讀次數(shù)：3493 發(fā)布時(shí)間：2019/12/17 10:06:39
| 可能原因 | 解決辦法 |
| 封閉不充分或封閉液不合適 | 選擇合適封閉液，并優(yōu)化封閉條件時(shí)間與溫度 |
| 抗體孵育濃度過高，孵育時(shí)間過長(zhǎng)或溫度過高 | 優(yōu)化抗體孵育濃度與時(shí)間 |
| 洗滌不充分 | 洗滌次數(shù)和時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng) |
| 二抗非特異性結(jié)合 | 設(shè)置二抗對(duì)照，并選擇合適的二抗試劑 |
| 干膜 | 操作過程中保持膜濕潤(rùn)狀態(tài) |
| 膜污染 | 操作過程保持膜整潔，不要用手按壓膜的任何部位 |
| 發(fā)光底物過度殘留 | 吸干多余發(fā)光液后進(jìn)行顯影 |
| 顯影時(shí)間過長(zhǎng) | 壓膠片時(shí)間長(zhǎng)短適宜，在顯影液中不要停留太長(zhǎng)時(shí)間 |
| 可能原因 | 解決辦法 |
| 樣本中所含目的蛋白表達(dá)量過低或無表達(dá) | 確認(rèn)樣本可行性，對(duì)表達(dá)過低的樣本進(jìn)行富集后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；更換超敏ECL并適當(dāng)延長(zhǎng)曝光時(shí)間 |
| 蛋白提取時(shí)降解 | 蛋白提取時(shí)，保持低溫狀態(tài)，并加入相應(yīng)的蛋白酶抑制劑 |
| 蛋白樣本保存條件不合適，蛋白降解 | 蛋白樣本建議加入。上樣緩沖液煮沸變性后保存，對(duì)于稀有樣本建議分裝于-80°C保存；避免反復(fù)凍存，盡快完成檢測(cè) |
| 蛋白轉(zhuǎn)膜效率低 | 麗春紅染色確認(rèn)轉(zhuǎn)膜體系是否正常 |
| 抗體孵育濃度過低或時(shí)間過短 | 優(yōu)化抗體孵育量，一抗建議4℃ 過夜孵育 |
| 一抗二抗檢測(cè)體系不匹配 | 選擇合適的一抗二抗 |
| 抗體失活 | 正確保存抗體 |
| 顯影液使用時(shí)間過長(zhǎng) | 使用新鮮試劑，并避光保存 |
| 可能原因 | 解決辦法 |
| Marker指示大小偏差 | 選擇合適的預(yù)染Marker,并與非預(yù)染 Marker對(duì)比，觀察差異大小 |
| 電泳體系影響 | 避免邊緣孔的不穩(wěn)定因素，在中間孔上樣，邊緣孔加入等量上樣緩沖液平衡體系 |
| 翻譯后修飾 | 查閱文獻(xiàn)，確認(rèn)蛋白本身是否存在磷酸化或糖基化等修飾 |
| 翻譯后剪切及異構(gòu)體 | 查閱文獻(xiàn)，確認(rèn)蛋白是否存在多種剪切活性形式 |
| 蛋白多聚體形成 | 蛋白二聚體或多聚體形成，在樣本制備過程中，使用新鮮的DTT或β-巰基乙醇，保持蛋白單體狀態(tài) |
| 蛋白相對(duì)電荷變化 | 蛋白氨基酸組成不同，某些蛋白所蓋，導(dǎo)致蛋白遷移率與蛋白大小不蓋，導(dǎo)致蛋白遷移率與蛋白大小不成正比 |
| 可能原因 | 解決辦法 |
| 反影或膜上可見黃色條帶 | 一抗二抗抗體濃度過高或樣本上樣量過大，導(dǎo)致酶被瞬間消耗 |
| 白色空點(diǎn) | 轉(zhuǎn)膜三明治制備時(shí)有氣泡，或者抗體孵育不均勻，應(yīng)在搖床上孵育 |
| 黑色斑點(diǎn)背景 | 封閉液顆粒殘留，在使用前應(yīng)充分?jǐn)嚢枞芙?/td> |
| 微笑條帶 | 條帶遷移過快，降低電壓； 膠凝固不均勻，正確制備凝膠 |
| 皺眉條帶 | 電泳時(shí)，電泳絲底物聚集大量氣泡，導(dǎo)致電壓不均衡 |
| 條帶拖尾 | 樣品內(nèi)有不溶物，離心或者優(yōu)化樣本蛋白提取；上樣量過載，降低上樣量；使用凝膠濃度不合適，蛋白分辨率較低，調(diào)整交聯(lián)劑比例；電泳液反復(fù)使用多次，重新配置新鮮電泳液 |
| 條帶扭曲 | 膠界面不平導(dǎo)致歪斜或凝膠制備不均勻；樣本中鹽離子濃度過高，干擾電泳；電壓過高，電泳遷移過快 |
| 條帶粘連，無孔間間隙 | 膠沒凝好，蛋白上樣量過大 |
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