上海恒遠(yuǎn)專注科研試劑的研發(fā)及銷售多年，涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，滿足您實(shí)驗(yàn)所需，以實(shí)現(xiàn)與客戶的雙贏，完善的庫存及供應(yīng)體系以及高效穩(wěn)定的專業(yè)技術(shù)，保證產(chǎn)品均能現(xiàn)貨供應(yīng)。期待您的來電。免疫組化實(shí)驗(yàn)?zāi)龅搅似款i腫么辦呢？別擔(dān)心，恒遠(yuǎn)小編給您出招啦！
一、標(biāo)本固定：
固定的目的是：
①防止標(biāo)本從玻片上脫落；
②除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；
③固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛。
二、脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要完全浸蠟、切片時刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。
三、脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先60度20min，但當(dāng)天制好的切片一般先60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易產(chǎn)生非特異性背景著色。
四、抗原修復(fù)：由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。
五、細(xì)胞通透：目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。
六、滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素：在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易受到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。
七、血清封閉：組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；一般室溫10-30min。但也要防止封閉過度。
八、一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間：一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中zui重要，包括孵育時間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果zui佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，4度過夜（從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min）。具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。
九、抗體稀釋液：其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。
十、切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長時間和增多次數(shù)）尤為重要。
注意：
①單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。
②溫柔沖洗，防止切片的脫落，一般用浸洗方式；
③沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。
④PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求（建議PH7.4-7.6，濃度是0.01M；中性及弱堿性條件有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）
十一、DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時即可沖洗。
十二、復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染（胞核染料）。
十三、封片：為了長期保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產(chǎn)生氣泡。
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