蛋白質定量貌似簡單的實驗，其實還是有一些學問的，蛋白質測定的方法有很多種，到目前為止還沒有哪種方法符合大眾所有的要求的，主要分為Bradford斑點試驗、Coomassie斑點試驗、紫外分光度檢測法以及BCA法。那今天恒遠小編就一一的給大家一一解析這其中的奧秘原理，歡迎您的查閱與參考！
一、Bradford法
該方法用于大多數蛋白質定量是相當精確的，特別是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污劑的濃度超過0。2%則影響定量結果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。
1.Bradford染液配制：將100mg考馬斯亮藍溶于50ml95%的乙醇中，加入100ml濃磷酸，然后，用雙蒸水補充至200ml，放4C至少6個月；
2.作標準曲線的蛋白質樣本的準備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準蛋白，例如進行抗體定量，可用純化的抗體作為標準蛋白。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標準蛋白。通常在20μg-150μg/100μl之間繪制標準曲線；
3.將待測樣本溶于100μl緩沖溶液中，該緩沖溶液應于作標準曲線的緩沖溶液相同；
4.按1：5用雙蒸水稀釋濃染料結合溶液，過濾離心沉淀物；
5.每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5-30min。染液與蛋白質結合后，將由紅色變?yōu)樗{色，即可在595nm光波長下測定其吸光度。注意，顏色反應不得超過30min；
6.標準曲線計算待測樣本的濃度。注意：應用Bradford法測定BSA的值是其重量的兩倍。
二、Bradford斑點試驗
該方法特別適用于檢測洗脫組分，以定位蛋白洗脫液。例如檢測洗脫液的吸附力的強弱。
1.首先，濃縮Bradford染液。將100mg考馬亮藍溶于50ml95%的乙醇中，加入100ml濃磷酸，然后，用雙蒸水補充至200ml，放4C至少6個月。這種染液也可從Bio-Rad公司購到；
2.將8μl待測蛋白質樣本轉移至一條Parafilm，SaranWrap上或微孔板孔中。同時應設一洗脫液樣本作為空白對照；
3.每個樣本孔中加2μl濃Bradford染液并混勻；
4.大約2min后，含有蛋白質的樣本將變藍。該方法的靈敏度約為10μg/ml。此反應對去污劑的濃度超過0。2%時非常敏感。但KCl，NaCl，MgCl2或EDTA對其無影響，Tris對其僅有輕微的影響。
三、Coomassie斑點試驗
該方法特別適用于檢測洗脫組分以定位蛋白洗脫液。例如檢測洗脫液的吸附力的強弱。
1.裁剪3MM厚的Whatman紙約4mm2；
2.每個樣本點5μl于Whatman紙上；
3.自然干燥樣本或用電吹風吹干斑點，約1min或更少；
4.將紙塊浸入0。25%的考馬斯亮藍溶液中(考馬斯亮藍溶于10%的甲醇，7%醋酸中)30min；
5.將紙塊放入10%的甲醇，7%醋酸溶液中洗滌3-5min，然后干燥。
四、紫外分光度檢測法
蛋白質紫外光吸光率是所有的蛋白質定量方法中最快的方法。通常在280nm光波長下讀數。其在280nm光波長下的最大吸光率主要處決于酪氨酸和色氨酸的存在。在205nm光波長的吸收也常用到。其在205nm光波長下的最大吸光率主要處決于肽鏈，盡管氨基酸也有影響。另外，一個主要的優(yōu)點是在測定蛋白質濃度時，樣本不會遭到損害。
1.純蛋白質溶液：
①在280nm光波長下讀取與適當的對照相比較的吸光率；
②對于抗體和BSA，可應用下表計算其濃度對其他蛋白質可粗約地估計：
1個單位吸光率相當于1mg/ml、蛋白質A280(1mg/ml)、IgG1.35、IgM1.2、BSA0.7
2.含有核苷酸的蛋白質溶液
①在280nm和260nm或280nm和205nm光波長下讀取與適當的對照相比較的吸光率；
②用下列等式粗略計算其濃度：
蛋白質濃度(mg/ml)=(1。55×A280)-(0。76×A260)
蛋白質濃度(mg/ml)=A205/(27+120A280/A205)
五、BCA法：
由標準曲線可以算出樣品原始濃度為14。28mg/ml
BCA法特點：
1.靈敏度高，檢測濃度下限達到25μg/ml，最小檢測蛋白量達到0。5μg，待測樣品體積為1-20μl。
2.測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學物質的影響，可以兼容樣品中高達5%的SDS，5%的TritonX-100，5%的Tween20，60，80。
3.在20-2000μg/ml濃度范圍內有良好的線性關系。
4.檢測不同蛋白質分子的變異系數遠小于考馬斯亮藍法蛋白定量。
5.受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巰基乙醇低于1mM
BCA法和Commassie法各有優(yōu)勢，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。
Bradford法、Coomassie法、紫外分光度檢測法以及BCA法各有優(yōu)缺點，要根據實驗的目的去選擇合適的蛋白定量方法，主要依據是緩沖液的化學組成和待測的蛋白的濃度。
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