閱讀次數(shù)：1670 發(fā)布時間：2018/1/23 11:18:42
ELISA分析雖然操作簡單，但一些關(guān)鍵點(diǎn)仍然不可忽視。今天上海恒遠(yuǎn)BIM試劑盒將教您如何正確的做好ELISA實(shí)驗(yàn)（操作篇），希望您會喜歡！
一、樣本前處理注意事項(xiàng)：
1、均質(zhì)。組織樣本：肉、肝食品類切細(xì)，用絞肉機(jī)反復(fù)絞碎，混合均勻。水產(chǎn)樣本：去除樣品的非食用部分，食用部分切細(xì)，用均質(zhì)器均漿；原料表面較臟時，需適當(dāng)用蒸餾水清洗。蛋類：鮮蛋去殼，蛋黃和蛋白充分混勻。水果、蔬菜類：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。
2、振蕩提取。 將提取溶劑加入到裝有樣品的具塞容器中，振蕩，使提取溶劑與容器內(nèi)的樣品充分接觸以深入到樣本組織內(nèi)部，提取待測組分。振蕩方式：振蕩器上進(jìn)行上下、往返式振蕩、手搖式上下振蕩。在組織樣本中加入有機(jī)溶劑之間提取時，應(yīng)邊加邊振蕩，防止組織凝結(jié)成團(tuán)，不利于提取。
3、在用有機(jī)溶劑提取過程中，如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，解決的方法有：一是用吸頭輕輕的攪拌，破壞乳化后，再重復(fù)離心。二是再加入適量的提取劑，重新振蕩。注意離心后要保證樣本的稀釋倍數(shù)不變。
4、濃縮。 由于凈化過程中引入的溶劑，可能會降低待測組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去除全部有機(jī)溶劑。即試劑盒前處理步驟中把樣本在60℃氮?dú)庀麓蹈�，再用�?fù)溶液溶解干燥殘留物。濃縮方式： 氮?dú)獯蹈沙s、壓縮空氣吹干除雜。注意：在吹干樣本之前，用甲醇清洗針頭，防止雜質(zhì)干擾。在吹樣本時，針頭應(yīng)在液面上空，避免與樣本接觸，防止產(chǎn)生交叉污染。樣本吹干后應(yīng)立即取下，避免吹的時間過長，影響最終檢測結(jié)果。不同的藥物，吹干后樣本的保質(zhì)期不同，提倡待樣本回到室溫后立即復(fù)溶。
5、凈化。 經(jīng)過提取的待測組分中通常含有一些會干擾免疫檢測中抗原抗體反應(yīng)的雜質(zhì)或者是含有與待測物結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)。將待測組分與雜質(zhì)分離的過程，我們稱為試劑盒中樣本的凈化。在我們現(xiàn)有的試劑盒前處理方法中涉及到的最常見的凈化是：液液分配法。
二、酶標(biāo)分析過程中的注意事項(xiàng)：
樣本的檢測是基于抗原抗體的反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，判定樣本最終的藥物含量。它要求加樣的準(zhǔn)確性和洗板的一致性。在整個加樣的過程中注意實(shí)驗(yàn)室溫度的恒定，保證反應(yīng)在試劑盒所示的溫度下進(jìn)行。
1、常見加樣方式：
①吸一打二（即加樣槍在吸液體時只打到第一檔，放液時放到第二檔。）
②吸二打一（即加樣槍在吸液體時打到第二檔，放液時只放到第一檔。）
在實(shí)際操作過程中，提倡用“吸二打一”用這種方式，有如下幾個好處：a、加樣過程中在板孔內(nèi)不出現(xiàn)或者很少出現(xiàn)氣泡；b、提高加樣速度，縮短前后樣本反應(yīng)的時間差。
在加樣的過程中還應(yīng)細(xì)心注意避免出現(xiàn)下列現(xiàn)象：①加樣的過程中漏加或者重加；②加樣的過程中忘記更換吸頭；③樣本的重加或者漏加；④忘記記錄樣本的加樣順序。
2、常見的洗板方式：
①洗板機(jī)洗板；
②多道孔加樣器洗板；
③多孔吸頭洗板；
在洗板的過程中，確保每孔所加洗滌液量的均一，按說明書操作，不可過多，避免溢出板孔，污染其它樣本；過少，則達(dá)不到洗滌的效果，容易出現(xiàn)曲線不成線性，花板等情況。
3、甩板：
快速甩盡板孔內(nèi)的液體，防止板孔里的液體對流或反濺回板孔中產(chǎn)生交叉污染。
4、拍板：
輕輕的在吸水紙上扣干板孔內(nèi)的液體，而且吸水紙只能使用一次。
5、顯色：
試劑盒中所規(guī)定的顯色時間并非是絕對的，環(huán)境中的溫度、濕度、酶標(biāo)板反應(yīng)時所接觸到的物品的導(dǎo)熱度等因素會影響吸光度值，實(shí)驗(yàn)操作人員在加完顯色液后，可根據(jù)顏色的深淺適當(dāng)?shù)难娱L或者縮短顯色時間。防止出現(xiàn)吸光值接近或高于酶標(biāo)儀的最高檢測限度（OD值在2.5-3.0之間），這樣會間接影響到檢測結(jié)果，如出現(xiàn)曲線前半部份梯度不明顯或顛倒數(shù)值等現(xiàn)象，也就造成了一些假陽性或部分檢測結(jié)果偏低的現(xiàn)象。
三、檢測結(jié)果判斷：
由于ELISA方法目前在獸藥、貝類毒素、真菌毒素殘留檢測中主要是用作篩選方法，其判定標(biāo)準(zhǔn)可以根據(jù)下列確定：
（1）有現(xiàn)成方法的，采用方法的檢測限作為判定標(biāo)準(zhǔn)，如農(nóng)牧發(fā)［2001］38號文規(guī)定豬尿中ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)為1 ng/mL；
（2）目前沒有現(xiàn)成標(biāo)準(zhǔn)，但可采用其他確認(rèn)方法的檢測限作為ELISA檢測的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如用ELISA檢測飼料中的鹽酸克侖特羅，可按 NY438-2001規(guī)定的 HPLC 法的最低檢測限0.05 mg/kg作為飼料 ELISA 法的判定標(biāo)準(zhǔn)；采用確認(rèn)方法的檢測限作為ELISA方法的判定限的依據(jù)是篩選方法的陽性結(jié)果要采用其他確認(rèn)方法進(jìn)行確證，采用低于確認(rèn)方法檢測限的數(shù)值作判定值可能會引起假陽性偏高；
（3）在空白樣品中添加要測定的藥物，看樣品基質(zhì)效應(yīng)的干擾情況，如用德國γ-biopharm試劑盒檢測飼料中的己烯雌酚，其推薦判斷標(biāo)準(zhǔn)為20 ng/g；
（4）陽性樣品需用其他方法進(jìn)行確證。ELISA法是快速篩選方法，由于受多種因素的影響有可能引起假陽性反應(yīng)，因而對于用該法檢測到的陽性樣品一定要用其他方法進(jìn)行確證，以排除假陽性結(jié)果。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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