閱讀次數(shù)：2084 發(fā)布時間：2017/11/28 10:03:44
ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，是目前廣泛應(yīng)用于各種抗原抗體檢測的方法，主要有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。ELISA操作步驟看似簡單，整個測定過程中卻有諸多影響因素，導(dǎo)致檢測結(jié)果可能與實(shí)際結(jié)果偏差較大。今天上海恒遠(yuǎn)將幫助大家分析實(shí)驗(yàn)中常見的十大問題及對應(yīng)的解決方法，希望能幫助到您：
問題一：高背景或陰性對照值偏高
| 可能原因 | 建議 |
| 陰性對照孔被陽性對照或樣品污染 | 洗滌時，勿將洗液溢出孔外 |
| 抗體非特異性結(jié)合 | 封閉液不適合，更換封閉液 |
| 酶結(jié)合物過濃 | 請檢查酶結(jié)合物是否按說明書規(guī)定稀釋 |
| 孵育溫度過高 | 檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定 |
| 底物在使用前曝光 | 應(yīng)保存在暗處，避光 |
| 讀板前停留時間過長 | 加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù) |
問題二：陽性對照值偏低或低吸光度
| 可能原因 | 建議 |
| 試劑未平衡至室溫 | 實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒從冰箱取出平衡至室溫 |
| 檢測體積偏小 | 檢查移液器吸液管道是否堵塞 |
| 孵育時間過短 | 使用計(jì)時器，準(zhǔn)確孵育時間 |
| 底物受污染 | 使用新配置的試劑，重新實(shí)驗(yàn) |
| 包裝袋中有濕氣 | 檢查袋中是否有干燥劑 |
| 樣本中有抑制劑 | 疊氮鈉會抑制HRP酶的活性 |
問題三：邊緣效應(yīng)
| 可能原因 | 建議 |
| 蒸發(fā) | 各步之間，須使用封版膠密封反應(yīng)板 |
| 溫度不均勻 | 校準(zhǔn)孵育箱，勿疊放反應(yīng)板 |
問題四：標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳
| 可能原因 | 建議 |
| 倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時未混勻 | 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的每一步均需混勻 |
| 過早稀釋 | 標(biāo)準(zhǔn)品在快要使用時稀釋 |
| 加入的體積不正確 | 使用校準(zhǔn)過的移液器，快速、等量的將標(biāo)準(zhǔn)品分配到各個微孔中 |
問題五：標(biāo)準(zhǔn)曲標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但樣本無檢測信號
| 可能原因 | 建議 |
| 樣本中無檢測物或檢測物含量極低 | 設(shè)置內(nèi)參，重新實(shí)驗(yàn) |
| 樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測 | 作適當(dāng)稀釋，降低其他物質(zhì)的干擾，或作系列稀釋，檢測回收率 |
| 樣本中檢測物濃度過高，Hook效應(yīng)導(dǎo)致假低值 | 適當(dāng)倍數(shù)稀釋樣本，檢測物濃度盡量在試劑盒檢測范圍內(nèi) |
問題六：重復(fù)性較差
| 可能原因 | 建議 |
| 微孔中有氣泡 | 用針尖挑破氣泡 |
| 試劑未混勻 | 確保充分混勻試劑 |
| 樣本中有雜質(zhì)或沉淀物 | 使用前離心 |
| 微孔包被面被吸頭劃破 | 加液時小心操作 |
| 使用用過的封板膠紙 | 每次須使用新的封板膠封住反應(yīng)孔 |
問題七：假陽性反應(yīng)
| 可能原因 | 建議 |
| 洗滌不充分 | 使用前需檢查洗板機(jī)是否正常工作 |
| 洗板機(jī)管道堵塞 | 需經(jīng)常維護(hù)洗板機(jī) |
| 加結(jié)合物時，灑在微孔邊緣 | 小心向微孔加入結(jié)合物，加入微孔底部中央，避免與孔壁和邊緣接觸 |
| 檢測樣本中含有紅細(xì)胞 | 離心 |
| 微孔中液體揮發(fā) | 用封板膠密封反應(yīng)孔，置于濕盒內(nèi) |
問題八：整塊板產(chǎn)生陽性O(shè)D值或整個板顯藍(lán)色
| 可能原因 | 建議 |
| 洗滌液體積不足或底物被殘留于孔底的結(jié)合物所污染 | 洗滌時，緩沖液充滿至孔邊緣，但要確保不能溢出孔外 |
| 結(jié)合物濃度過高 | 檢查是否按照說明書推薦比例稀釋 |
| 血清中有血清因子 | 勿加熱血清 |
| 底物容器不潔凈 | 用酸清洗容器瓶，用蒸餾水沖洗 |
| 底物孵育時，微孔板曝光 | 加底物時，立即將板置于暗處 |
問題九：整塊板OD值偏低
| 可能原因 | 建議 |
| 顯色時間不足 | 適當(dāng)延長顯色時間 |
| 孵育溫度偏低 | 36度為最適反應(yīng)溫度（上海恒遠(yuǎn)ELISA試劑盒） |
| 未加終止液 | 加入終止液，增強(qiáng)顏色反應(yīng)的強(qiáng)度，穩(wěn)定最終的顏色反應(yīng) |
問題十：顯色緩慢
| 可能原因 | 建議 |
| 樣本未置于室溫 | 實(shí)驗(yàn)開始前，將樣本平衡至室溫 |
| 酶結(jié)合物活性減弱 | 檢測稀釋度 |
| 酶活性收到抑制如疊氮鈉 | 避免實(shí)驗(yàn)不當(dāng)?shù)姆栏瘎?/td> |
| 顯色溫度不適當(dāng) | 按說明書操作 |
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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