ELISA實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作的要點(diǎn)有很多，每個(gè)要點(diǎn)都是決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素，今天上海恒遠(yuǎn)就為大家詳細(xì)分析下固相載體這個(gè)操作要領(lǐng)。
可作ELISA中載體的物質(zhì)很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在ELISA測(cè)定過程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。
ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點(diǎn)是還能兼作反應(yīng)的容器，最后放入分光光度計(jì)中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動(dòng)淋洗，效果更好。最常用的載體為微量反應(yīng)板，專用于ELISA測(cè)定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，國際通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測(cè)，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在特定的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果�，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量反應(yīng)板型的ELISA檢測(cè)，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號(hào)的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測(cè)每孔溶液的吸光度。控制反應(yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計(jì)算所有讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10％。
與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割，價(jià)廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時(shí)也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測(cè)定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗(yàn)：用其它免疫學(xué)測(cè)定方法選出一個(gè)典型的陽性標(biāo)本和一個(gè)典型的陰性標(biāo)本。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測(cè)定，然后比較測(cè)定結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果判別最大，這種載體就是這一ELISA測(cè)定的最合適的固相載體。
除塑料制品外，固相酶免疫測(cè)定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測(cè)定形式將在本章第五節(jié)“膜載體的酶免疫測(cè)定”中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應(yīng)時(shí)固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應(yīng)的速率，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。
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