Elisa，如何選擇儀器的吸光度值？是都選擇450nm，還是根據(jù)測得指標不同，選擇不同的波長？
ELISA檢測波長根據(jù)酶的底物最大吸收波長而定的，OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰。HRP底物OPD反應(yīng)酸終止后最大吸收峰為492nm，HRP底物TMB的話就選擇450nm。
一、辣根過氧化物酶HRP
HRP最常用的色原底物有鄰苯二胺（OPD）、2，2’—吖嗪—（3—乙酰苯基噻唑磺酸—6）[2，2’—azino-di（3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6），ABTS]（雜環(huán)吖嗪）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和4—氨基安替比林：苯酚耦聯(lián)底物對等。上述色原底物受HRP作用主要有兩種形式的反應(yīng)：①氧化還原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一個氨基芳香劑與另一個芳香基化合物的氧化耦聯(lián)，如4—氨基安替比林：苯酚等。
1、氧化還原色原底物
OPD被認為是HRP最為敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由過氧化氫（H202）氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯（DAB）。在pH5.0左右時，DAB在波長450nm處有廣范圍的最大吸收，當pH值降為1.0時，最大吸收波長移動至492nm，同時摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深（圖4—2）。因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。實際工作中，用強酸尤其是鹽酸終止反應(yīng)后，顯色并不穩(wěn)定，常隨時間增長而顏色加深，這是由于反應(yīng)后剩余的過氧化氫繼續(xù)氧化OPD而產(chǎn)生非酶催化的DAB的結(jié)果。有人在強酸反應(yīng)終止液中加入還原劑如亞硫酸鈉，因還原劑可迅速完全地將剩余的過氧化氫還原而阻止了OPD的非酶氧化，結(jié)果顯色穩(wěn)定，數(shù)十小時內(nèi)不變，而且無需避光。OPD的缺點是其對機體具有致突變作用。由于OPD的不穩(wěn)定性，現(xiàn)在的商品試劑盒中，OPD均以片劑或粉劑供應(yīng)，臨用時再溶解于相應(yīng)的緩沖液。
在ELISA測定時，OPD色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：在0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH5.0）中含20 mmol/L OPD和12 mmol/L H202，或10 mmol/L OPD和5.5mmol/L H202；②終止液：2 mol/L硫酸（含0.1 mol/L亞硫酸鈉）；③測定波長：492nm。
TMB是一種優(yōu)于OPD的新型HRP色原底物。其氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有最大消光系數(shù)，如果HRP量少，過氧化氫溶液和TMB過量時，則形成藍色的陽離子根。降低pH，即可使藍色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌（圖4—3）。使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min，但隨后本底顯色就不斷加深，國內(nèi)有人認為使用1％SDS作為終止劑，可使鮮藍色24h內(nèi)保持不變，陰陽性對比十分明顯，但在我們實驗室發(fā)現(xiàn)1％SDS對上述顯色有較強的褪色作用，目前仍以硫酸作為終止劑較為理想。ELISA中，底物反應(yīng)顯色后，常選擇其具最大吸收的波長450nm比色測定結(jié)果。而’Madersbacher和Berger等為提高以TMB作底物的ELISA測定的敏感性，選擇顯色呈指數(shù)加深時的波長405nm比色測定。他們首先測定一系列已知濃度的標準品在450nm和405nm的值，證實A450nm/A405nm之比為3.2，然后在使用波長405nm測定含低濃度待測物的標本得到的OD值再乘以常數(shù)3.2，即為待測標本在波長450nm處的真值。該種雙波長測定方法可使ELISA測定范圍提高3倍。TMB的顯色反應(yīng)雖與OPD一樣同屬氧化還原反應(yīng)，但前者的反應(yīng)是可逆的，如終止液中存在還原劑（維生素C及亞硫酸鈉、SDS等），則可反應(yīng)顯色迅速消退。TMB雖然溶解度相對較低，但由于其高檢測敏感性及無致突變作用，現(xiàn)已基本上取代了OPD而成為HRP最為常的色原底物。
在商品ELISA試劑盒尤其是國內(nèi)的產(chǎn)品中，TMB色原底物常為已配好的A及B兩種液態(tài)試劑，其中一種是含一定濃度過氧化氫的溶液，一種為TMB溶液，鑒于過氧化氫、TMB在溶液中相對不穩(wěn)定的特點，因此，我們在使用ELISA試劑盒時，如發(fā)現(xiàn)底物A和（或）B出現(xiàn)顏色，或二者各取一滴混合后顯色，說明該試劑盒的底物溶液已變質(zhì)或已受污染，必須廢棄。
在ELISA測定時，TMB色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將TMB以0.1 mol/L的濃度溶于二甲亞砜，然后，再將其以1 mmol/L和H202以3.0 mmol/L的濃度溶于0.2mol/L醋酸鈉/枸櫞酸緩沖液（pH4.0），即可應(yīng)用。②終止液：2 mol/L硫酸。③測定波長：450nm。
ABTS也是HRP的一種高靈敏底物。在H：O：存在下，ABTS的氨鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橐装l(fā)生歧化的陽離子根（圖4—4）。陽離子根為綠色，與OPD的黃色氧化產(chǎn)物相比更適于可見光測定（測定波長入＝414nm）。上述顯色也不穩(wěn)定，10 mmol/L疊氮鈉是較為理想的終止劑，可使顯色穩(wěn)定數(shù)十小時，且可減少陽離子根的歧化。另有人報道用1.25％NaF終止反應(yīng)效果較好。
ABTS在目前國內(nèi)的ELISA試劑盒中基本上沒有應(yīng)用，但在國外ELISA試劑盒偶見有應(yīng)用。
在ELISA測定時，ABTS色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將ABTS以2 mmol/L和H202以2.5 mmo!/L的濃度溶于0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 4.2），即可應(yīng)用；②終止液：10 mmol/L疊氮鈉；③測定波長；414nm或405nm。
除上述三種外，HRP的氧化還原底物尚有O-dianisidine（ODA），5—氨基水楊酸（5—AS）以及dicarboxindine等。
2、氧化耦聯(lián)色原底物對
HRP的氧化耦聯(lián)色原底物對主要有4—氨基安替比林：苯酚耦聯(lián)底物對（Trinder試劑）和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦聯(lián)底物對（Ngo—Lenhoff試劑）等。
在H202存在下，4—氨基安替比林和苯酚經(jīng)HRP作用縮合形成紅色的醌亞胺，其在入＝492 nm處有最大吸收（圖4—5）。
該耦聯(lián)色原底物對用于固相ELISA時，敏感性一般較低，反應(yīng)見光不穩(wěn)定，而且苯酚易發(fā)生多聚化，缺乏適當?shù)姆磻?yīng)終止劑。因此，該試劑常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等臨床生化指標的酶法檢測應(yīng)用。1989年日本學(xué)者用其作為色原底物建立了一種以HRP作標記酶的均相酶免疫試驗，可用甲醛終止反應(yīng)。但這種方法僅停留在實驗室階段，其后也未見有其他實驗室的應(yīng)用報道，可能還有其固有的缺陷。
4—氨基安替比林：苯酚耦聯(lián)底物對色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將4—氨基安替比林以2 mmol/L，苯酚以25 mmol/L和H202以0.8 mmol/L的濃度溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2），即可應(yīng)用；②終止液：未見報道；③測定波長：492nm。
MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍色的吲達胺（indamine），最大吸收波長為590nm，見光不穩(wěn)定。用鹽酸或硫酸終止反應(yīng)后，pH應(yīng)為3.0左右，pH值的降低使顯色從紫藍色轉(zhuǎn)變?yōu)榍逦乃{色，最大吸收波長從590nm變?yōu)?95nm，然而pH值的進一步降低，將導(dǎo)致光吸收消失。
MBTH：DMA耦聯(lián)對在固相ELISA測定幾乎沒有應(yīng)用。
二、堿性磷酸酶（AP）
在ELISA測定中，堿性磷酸酶的色原底物最常用的是對硝基苯磷酸鹽（p-nitropheny—phosate，pNPP）。pNPP在堿性磷酸酶的作用下生成對硝基酚（pNP），其在入＝405 nm處有最大吸收.
由于堿性條件下pNP的光吸收增強，并可使堿性磷酸酶失活，因而可使用碳酸鈉作為終止劑。二乙醇胺緩沖液中不能有單乙醇胺，因為單乙醇胺對堿性磷酸酶有溫度依賴的抑制作用。較高濃度的無機磷可競爭性地抑制堿性磷酸酶的活性，pNPP貯存時間過長由于非酶水解而產(chǎn)生硝基酚和磷酸鹽時即可出現(xiàn)這種情況，此時pNPP呈黃色。
因此，用于ELISA測定時，pNPP必須絕對五色。pNP的摩爾消光系數(shù)（光吸收）的變化取決于溶液的pH及溫度、離子強度、蛋白含量，當溫度從15~C升高至45℃時，pNP在入＝405 nm處的光吸收將增加5％～7％。
在ELISA測定時，pNPP色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將pNPP以10 mmol/L的濃度溶于含1 mmol/LMgCl：的0.1 mol/L二乙醇胺緩沖液（pH 9.8），即可應(yīng)用；②終止液：0.5 mol/L碳酸鈉；③測定波長：405nm。
原創(chuàng)作者：上海恒遠生物科技有限公司
