Elisa實(shí)驗(yàn)檢測：十種樣本收集儲(chǔ)存及處理辦法
根據(jù)小編所知;能夠應(yīng)用ELISA 實(shí)驗(yàn)的樣本種類很多，有血清，血漿，細(xì)胞上清，細(xì)胞裂解液，尿液，關(guān)節(jié)滑液，腦脊液，肺泡灌洗液，各種組織的組織勻漿；采集和處理的方式都不相同,為了使客戶更加了解Elisa試劑盒樣本收集，我司結(jié)合公司實(shí)際，將 收集的各類樣本的采集、處理和保存方式。方法大多出自文獻(xiàn)和試劑盒說明書，部分方法經(jīng)我司驗(yàn)證過，但有的方法并沒有實(shí)際操作過，所以，以下方法僅供參考。
一、ELISA實(shí)驗(yàn)中血清的采集、處理和保存；
1、 真空采血針采集2ml新鮮血液，加入無菌試管中；
2、 采血后室溫靜置1小時(shí)；
3、 將采集血液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心10min，，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。
4、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?br />2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；
-20℃下，可放置保存1個(gè)月；
-70℃下，可放置保存6個(gè)月；
5、 根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。
大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的 ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。此外還應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榫w中可能含有含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。血清標(biāo)本宜在新鮮 時(shí)檢測。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。
二、ELISA實(shí)驗(yàn)中血漿的采集、處理和保存；
1、 真空采血針采集2ml新鮮血液，加入無菌試管中；
2、 按1:9加入抗凝劑（EDTA、草酸鈉、肝素、枸櫞酸鈉），30分鐘內(nèi)于冰上分離血漿以減少血小板的污染；（也可以直接用抗凝管采集）；
3、 將采集血液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心5min，，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。
4、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?br />2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；
-20℃下，可放置保存1個(gè)月；
-70℃下，可放置保存6個(gè)月；
5、 根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。 請注意指標(biāo)說明書上對(duì)于抗凝血?jiǎng)┦欠裼刑厥庖�，建議使用EDTA。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。
注意事項(xiàng)：制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑EDTA,抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白原干擾而造成假陽性。
三、ELISA 實(shí)驗(yàn)中尿液的采集、處理和保存；
1、 采集尿液樣本500ul，加入無菌試管中；
2、 將采集血液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心10min，，將離心好的樣本留上清，棄下面沉淀。
3、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?br />2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；
-20℃下，可放置保存1個(gè)月；
-70℃下，可放置保存6個(gè)月；
4、 根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。
四、ELISA 實(shí)驗(yàn)中腦脊液的采集、處理和保存；
1、采集腦脊液樣本，加入無菌試管中；
2、將采集血液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心10min，，將離心好的樣本留上清，棄下面沉淀。
3、取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?br />2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；
-20℃下，可放置保存1個(gè)月；
-70℃下，可放置保存6個(gè)月；
4、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。
五、ELISA 實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞上清液的采集、處理和保存；
1、采集細(xì)胞培養(yǎng)上清液500ul，加入無菌試管中；
2、將采集血液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心10min，，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。
3、取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?br />2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；
-20℃下，可放置保存1個(gè)月；
-70℃下，可放置保存6個(gè)月；
4、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。
六、ELISA 實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞裂解液的采集、處理和保存；（需要測蛋白濃度）
1、 取細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞懸液，用PBS（PH7.2-7.4）洗滌細(xì)胞培養(yǎng)板1-2次。
2、 通過反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑（裂解液），使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。
3、 將采集血液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心20min，，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。
4、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?br />2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；
-20℃下，可放置保存1個(gè)月；
-70℃下，可放置保存6個(gè)月；
5、 根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。
七、ELISA 實(shí)驗(yàn)中肺泡灌洗液的采集、處理和保存；
1、 10%水合氯醛溶液，腹腔麻醉。
2、 打開腹腔，另取10ml注射器行下腔靜脈采血，盡可能將血放盡。
3、 在冰面上對(duì)左肺進(jìn)行肺灌洗。取37℃生理鹽水5ml，分三次灌洗：2ml、1.5ml、1.5ml灌洗�；厥章试�70%以上。
4、 將肺泡灌洗液用離心機(jī)4℃，1500rpm離心10min。
5、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?br />2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；
-20℃下，可放置保存1個(gè)月；
-70℃下，可放置保存6個(gè)月；
6、 根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。
八、ELISA 實(shí)驗(yàn)中關(guān)節(jié)滑液的采集、處理和保存；
1、 口腔關(guān)節(jié)：患者取坐位，常規(guī)消毒后，作皮下及關(guān)節(jié)后區(qū)局部浸潤麻醉。然后囑患者大張口，采用裝有2ml生理鹽水的注射器（5號(hào)針頭）作關(guān)節(jié)上腔 穿刺，髁后進(jìn)針，針尖方向斜向前、內(nèi)、上，抵達(dá)關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)后斜面后稍后退，回抽如發(fā)現(xiàn)有淡黃色液體，即表明已進(jìn)入關(guān)節(jié)上腔，注入2ml生理鹽水，反復(fù)注入、 回抽五次。
膝骨關(guān)節(jié)滑液：無菌穿刺取得關(guān)節(jié)液。
2、 將關(guān)節(jié)液用離心機(jī)4℃，1500rpm離心15min，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。
3、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?br />2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；
-20℃下，可放置保存1個(gè)月；
-70℃下，可放置保存6個(gè)月；
4、 根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。
九、 ELISA實(shí)驗(yàn)中各類組織勻漿（容易勻漿的組織）的采集、處理和保存；（需要測蛋白濃度）
1、 采集組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，剔除附屬的結(jié)締組織，稱取組織塊。
2、 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86％冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍，用眼科小剪盡快剪碎組織塊（天然時(shí)操作要在冰水浴中進(jìn)行，將盛有組織 的小燒杯放入冰水中）。
3、 勻漿的方式有多種：
a) 手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿，左手持勻漿管將下 端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6～8分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。
b) 機(jī)器勻漿：用組織搗碎機(jī)10000～15000r/min上下研磨制成10％組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備（勻漿時(shí)間10秒/次，間隙30秒，連續(xù)3～5次，在冰水中進(jìn)行），皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時(shí)間。
4、 將制備好的10％勻漿用離心機(jī)4℃，3000rpm離心15min，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。
5、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?br />2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；
-20℃下，可放置保存1個(gè)月；
-70℃下，可放置保存6個(gè)月；
6、 根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。
十、ELISA實(shí)驗(yàn)中各類組織勻漿（不易勻漿的組織）的采集、處理和保存；（需要測蛋白濃度）
7、 采集組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，剔除附屬的結(jié)締組織，稱取組織塊。
8、 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86％冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍，用眼科小剪盡快剪碎組織塊（天然時(shí)操作要在冰水浴中進(jìn)行，將盛有組織 的小燒杯放入冰水中）。
9、 勻漿的方式有多種：
a) 手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿，左手持勻漿管將下 端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6～8分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。
b) 機(jī)器勻漿：用組織搗碎機(jī)10000～15000r/min上下研磨制成10％組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備（勻漿時(shí)間10秒/次，間隙30秒，連續(xù)3～5次，在冰水中進(jìn)行），皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時(shí)間。
c) 超聲粉碎：用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用40安培，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3～5次。
10、 將制備好的10％勻漿用離心機(jī)4℃，3000rpm離心15min，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。
11、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?br />2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；
-20℃下，可放置保存1個(gè)月；
-70℃下，可放置保存6個(gè)月；
12、 根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。
上海恒遠(yuǎn)生物建議：
1、 只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。
2、 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測標(biāo)本含量，如果標(biāo)本濃度過高，應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋，使稀釋后的標(biāo)本符合試劑盒的檢測范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
3、 若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性，并注意留存樣本。
4、 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。
5、 若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素 較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)間等，所以可能存在檢測不出的情況。
6、 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。
7、 建議使用新鮮樣本，保存時(shí)間過長可能會(huì)存在蛋白降解或變性導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏 差。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
