閱讀次數(shù)：880 發(fā)布時(shí)間：2015/10/14 10:31:33
檢測(cè)血小板活化因子(PAF)，現(xiàn)用得較多的有生物法和物理學(xué)方法。因生物法缺乏特異性，物理學(xué)方法價(jià)格昂貴，操作繁瑣，90年代以來，國(guó)外開始用放射免疫法檢測(cè)PAF。我們?cè)囉妹嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)雙抗體夾心法檢測(cè)PAF，報(bào)告如下。
一、材料和方法
1.材料：腎小球腎炎病人血漿標(biāo)本各20份。PAF標(biāo)準(zhǔn)品、雞卵清蛋白為Sigma產(chǎn)品，辣根過氧化物酶(HRP，上海恒遠(yuǎn)生物工程公司)，硼氫化鈉等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭�。DG-3022A酶標(biāo)儀。96孔酶標(biāo)板。
2.PAF抗體和酶標(biāo)PAF抗體制備和鑒定：(1)參照文獻(xiàn)改良制備出PAF免疫原，皮下和足底加淋巴結(jié)注射免疫新西蘭白兔，免疫5次。用飽和硫酸胺沉淀法與DEAE-23層析柱法提取免疫血清中的PAF抗體，聚乙二醇濃縮后分裝凍存。(2)用過碘酸鈉氧化結(jié)合法制備HRP標(biāo)記的PAF抗體，SephadeXG100過濾純化，測(cè)酶標(biāo)PAF抗體A280nm和A403nm值。(3)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA法測(cè)PAF抗體效價(jià)及鑒定其特異性，并鑒定酶標(biāo)PAF抗體中酶與抗體的活性。
3.包被抗體稀釋度與酶標(biāo)抗體工作濃度：(1)按對(duì)照法，抗體(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3 200、1∶6 400)包被，雞卵清蛋白封閉，PAF標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg/ml)，酶標(biāo)抗體(1∶800)并加底物，測(cè)A490nm值。(2)步驟同上，改包被抗體為1∶1600，酶標(biāo)抗體按(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3200、1∶6 400)濃度稀釋。
4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：用純化的抗體(1∶1 600)包被，雞卵清蛋白封閉，用PAF標(biāo)準(zhǔn)品(0.5、1、2、5、10、20、40、80、160 ng/ml)、酶標(biāo)抗體(1∶1 600)，加底物測(cè)A490nm值。
5.血漿樣品分析：(1)提取標(biāo)本中的脂質(zhì)，加入二乙醚中溶解，離心取上清液待測(cè)。(2)ELISA法檢測(cè)：步驟同4，只是將PAF標(biāo)準(zhǔn)品換成處理后的標(biāo)本(每一標(biāo)本做6孔)。(3)生物活性檢測(cè)法：先制出PAF標(biāo)準(zhǔn)品所致的血小板聚集程度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。提取的待檢標(biāo)本經(jīng)薄層層析后血小板自動(dòng)平衡儀檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出PAF的含量。
二、結(jié)果
1.雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)得免疫血清最高效價(jià)為1∶32，免疫血清與PAF之間出現(xiàn)一條明顯的沉淀線，與溶PAF、膽固醇等之間無沉淀線；酶標(biāo)PAF抗體與PAF之間產(chǎn)生一條沉淀線，沉淀線用生理鹽水漂洗后，加OPD底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)。ELISA測(cè)得免疫血清最高效價(jià)為1∶10240。特異性試驗(yàn)：PAF抗原孔P/N≥2.1(5.94)，溶PAF、膽固醇等孔P/N均小于2.1。ELISA法顯示酶和抗體都有生物學(xué)活性。
2.酶標(biāo)抗體克分子比值：酶(g/L)×4/IgG(g/L)=1.2。
3.包被抗體和酶標(biāo)抗體稀釋度均為1∶1 600時(shí)，A490nm的值接近1.0，為較好的工作濃度。ELISA夾心法標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表明，PAF在2～80 ng/ml范圍內(nèi)曲線線性較為良好。
4.正常人血漿中的PAF值為(4.6±2.7) μg/L(ELISA法)，(3.5±2.4) μg/L(生物法)，病人血漿中的PAF值為(12.7±4.4)μg/L(ELISA法)，(9.8±3.6) μg/L(生物法)。正常人與病人PAF值采用均數(shù)t檢驗(yàn)，P＜0.01。
5.20份標(biāo)本每份以6孔測(cè)定，平均批內(nèi)誤差0.048，在3次不同檢測(cè)中，平均批間誤差0.110。
三、討論
現(xiàn)無公認(rèn)的可靠、快速、靈敏、實(shí)用的檢測(cè)PAF方法，主要是因?yàn)镻AF在體內(nèi)含量低，不易測(cè)出，且半衰期短，不易捕捉。我們先制備出抗PAF免疫血清，成功地提取PAF抗體并制備出HRP標(biāo)記PAF抗體，通過雙向瓊膽擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA鑒定，PAF抗體有較好效價(jià)和特異性，酶標(biāo)PAF抗體中，酶和抗體都有生物學(xué)活性。在探討ELISA法時(shí)，因考慮到ELISA間接法中，PAF作為一種脂類，包被較為困難，且PAF標(biāo)準(zhǔn)品昂貴，此法PAF用量較多，ELISA競(jìng)爭(zhēng)法及ABC-ELISA法較為繁瑣，因此我們采用了ELISA夾心法。
為驗(yàn)證所建立方法的可靠性，我們對(duì)20名正常人和20例腎小球腎炎病人的血漿標(biāo)本進(jìn)行了PAF測(cè)定，同時(shí)用生物法檢測(cè)作對(duì)照，兩種方法均測(cè)出正常人和病人血中的PAF，并且二者呈較好的平行相關(guān)。對(duì)于腎小球腎炎病人血液中PAF升高已基本得到公認(rèn)，本試驗(yàn)建立的ELISA法所測(cè)得同一標(biāo)本的值較生物法高，可能與標(biāo)本中的PAF沒有經(jīng)過進(jìn)一步純化等有關(guān)。
PAF是一種極為重要的炎癥介質(zhì)，在諸多的生理和病理情況下發(fā)揮激素樣的生物學(xué)作用。我們檢測(cè)PAF所用的ELISA夾心法較為簡(jiǎn)便，特異性、靈敏度、重復(fù)性均較好，比較實(shí)用可靠，在一定的范圍內(nèi)能反映PAF的含量，值得進(jìn)一步探索。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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