閱讀次數(shù)：1029 發(fā)布時(shí)間：2015/9/16 9:56:54
在做ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)過程中，難免會遇到各種不同的問題，比如標(biāo)準(zhǔn)曲線不好，試劑盒的回收率，假陰性，假陽性，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性不好等等。ELISA試劑盒現(xiàn)在就來一一解答用戶們在實(shí)驗(yàn)過程中遇到的各種疑問！
ELISA試劑盒曲線問題：
1.OD值不正常
試劑盒未回溫，試劑盒回溫到25℃
溫度控制不好，控制正確溫度
孵育時(shí)間不準(zhǔn)確，控制孵育時(shí)間
洗滌時(shí)沖擊力太大、浸泡時(shí)間過長、洗滌次數(shù)增 加，洗滌4-5次，每孔250ul，然后拍干
陽光直射，對著風(fēng)直接吹，避風(fēng)避
酶標(biāo)儀的波長錯(cuò)誤，酶標(biāo)儀的波長450nm
抗體的稀釋錯(cuò)誤，正確的稀釋抗體
水質(zhì)問題，用娃哈哈礦泉水代替
2.白 板
洗滌液配制錯(cuò)誤，正確的配制洗滌液
少加液體（錯(cuò)加液體），正確的步驟加液體
3.無 梯 度
標(biāo)準(zhǔn)品也污染，換標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)板
OD值不正常，控制溫度時(shí)間在做一次
人為點(diǎn)板，不要點(diǎn)板
4.線 性 不 好
OD值不正常，控制溫度時(shí)間在做一次
ELISA試劑盒回收率
1.空白管陽性高
樣本本身就是陽性樣本，換陰性樣本做回收率
空白管在實(shí)驗(yàn)中被污染，實(shí)驗(yàn)中防止交叉污染
水質(zhì)原因用，娃哈哈礦泉水代替
2.偏 高
添加量不準(zhǔn)確，精準(zhǔn)的添加量
添加濃度不適合，ELISA試劑盒添加合適的濃度
取液吹干量多，準(zhǔn)確的取液吹干
取到其它相層液體，取需用相吹干
復(fù)溶液未稀釋或加入量少，正確的稀釋復(fù)溶液
ELISA試劑盒3.偏 低
添加量不準(zhǔn)確，精準(zhǔn)的添加量
添加濃度不適合，添加合適的濃度
取液吹干量少，準(zhǔn)確的取液吹干
復(fù)溶液稀釋錯(cuò)誤或加入量多，正確的稀釋復(fù)溶液
假陰、陽性
1，水質(zhì)原因：點(diǎn)復(fù)溶液驗(yàn)證，用娃哈哈礦泉水代替
2，實(shí)驗(yàn)操作原因
吸取到其它相吹干，準(zhǔn)確的取液吹干
離心不徹底，延長離心時(shí)間
樣本的污染，更換樣本
乳化未處理完全，溫�。�70℃）處理乳化現(xiàn)象
3，儀器試劑原因
離心管未清洗干凈，正確的洗滌器具
有機(jī)溶劑的影響，ELISA試劑盒做試劑空白看影響結(jié)果
4，衍生化試劑原因（長時(shí)間衍生化試劑變質(zhì)）,更換衍生化試劑
5，與曲線好壞相關(guān),，保證曲線的正常
4．邊緣效應(yīng)
使用96孔板的ELISA測定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)"，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測定中，將板從室溫(通常在25℃左右)置于37℃溫箱，板也升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度(如37℃)，就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)"，并且可提高測定的重復(fù)性。
5．加樣
在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。
原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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