恒遠(yuǎn)解析蛋白質(zhì)（免疫）印跡
A. 樣品準(zhǔn)備
樣品準(zhǔn)備適用于單層細(xì)胞，細(xì)胞懸液和組織樣品。
單層細(xì)胞
•細(xì)胞在 100 mm x 20 mm 有蓋培養(yǎng)皿中生長至將近鋪滿。移去細(xì)胞培養(yǎng)液，用室溫的 1x PBS （10X liquid PBS: sc-24946）沖洗。以下步驟應(yīng)在冰上或 4° C 下進(jìn)行，用新鮮的冰置緩沖液。
•單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加 0.6 ml RIPA 緩沖液（sc-24948）。4° C 下輕輕搖動(dòng) 15 分鐘。用刮棒將粘附的細(xì)胞刮起。裂解液移至微離心管。
•用 0.3 ml RIPA 緩沖液沖洗培養(yǎng)瓶并倒入前述細(xì)胞裂解液。（也可加 10 µl 10 mg／ml PMSF (產(chǎn)品編號(hào) sc-3597)儲(chǔ)存液和／或通過21號(hào)針頭以打斷DNA）置于冰上裂解 30 分鐘。
•細(xì)胞裂解液4℃，10,000xg， 離心 10 分鐘。上清液為全細(xì)胞裂解液。將上清移至另一新微離心管，即提取的全細(xì)胞裂解液。如果想增加蛋白的提取量，可用少量的 RIPA 緩沖液重懸沉淀。離心后上清液，與之前上清液混合。
懸浮細(xì)胞
•室溫下通過低速離心（200xg）5 分鐘，收集大約 2.0x107 細(xì)胞。小心移去培養(yǎng)基。
•室溫下用 PBS 洗滌細(xì)胞沉淀，然后再次用低速離心收集細(xì)胞。小心移去上清。
•加 1.0 ml 冰冷 RIPA 緩沖液（sc-24948）。RIPA 緩沖液使用前新加入（蛋白酶抑制劑）和/或（磷酸酶抑制劑）。用移液管輕輕重新懸浮細(xì)胞，置于冰上裂解 30 分鐘。
•進(jìn)一步用水壓破碎法（21 號(hào)針）、勻漿器或超聲制備細(xì)胞均漿。切記勿使裂解液溫度升高（可加入 10 mg/ml PMSF 儲(chǔ)存液 10 µl : sc-3597）冰浴 30 分鐘。
•將細(xì)胞勻漿移至微離心管，10,000g，4℃，離心 10 分鐘。上清液即全細(xì)胞裂解液，將上清液移至一個(gè)新的微離心管。這就是您的全細(xì)胞裂解液。如果想增加蛋白的提取量，可用少量的RIPA緩沖液重懸沉淀,離心后取上清液，與前面上清液混合。
組織樣品
•給組織稱重并用干凈的刀片將其切成很小的塊。冰凍組織應(yīng)切成非常薄的薄片，并在含有（蛋白酶抑制劑 ）和/或(磷酸酶抑制劑）的 RIPA 緩沖液（sc-24948）中解 凍。每克組織約使用3 ml冰RIPA緩沖液。
•進(jìn)一步用勻漿器或超聲制備細(xì)胞勻漿。所有操作保持在 4°C。（每克組織可加入 10mg／ml PMSF 儲(chǔ)存液 30 µl : (sc-3597)）置于冰上 30 分鐘。
•移至微離心管 10,000xg，4° C 下離心 10 分鐘。上清移至新的離心管中再離心。上清液即全細(xì)胞裂解液。必要時(shí)延長離心時(shí)間以獲得澄清的裂解液。
B. 電泳
•樣品（每道上樣量：40－60 µg 全細(xì)胞裂解液，10－20 µg 去胞核或 10－20 ng 純化蛋白）與同體積的 2 倍濃度的電泳上樣緩沖液（sc-24945）混合并煮沸 2－3 分鐘。多余的樣品可儲(chǔ)存在 －20° C。
•每道寬 1.0 mm，厚 0.7 mm 的膠最大上樣量為 10 µl。
•我們建議你使用 Cruz Marker™ 標(biāo)準(zhǔn)分子量（ sc-2035）。 0.75 mm的膠每孔上樣 2 μl，1.5 mm的膠每孔上樣 5 μl。如果用與二抗匹配的Cruz Marker™ ，加入檢測(cè)試劑后，將出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)條帶。另外也可以使用預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)分子量 (sc-2361)。
•根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行電泳。
•用 electroblotting apparatus 將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或 PVDF 膜上。操作方法參照廠家說明書進(jìn)行。
C. 免疫染色
•把膜放在封閉液封閉非特異性片段（Blotto A 或者 Blotto B; 如果用抗牛的二抗，建議用無IgG的 BSA, sc- 2323），室溫下孵育 30-60 分鐘。 (UltraCruz™ 孵化盤 提供多種顏色的200ml或120ml)也可以把膜放在4℃，使用不帶Tween-20的Blotto，過夜封閉。
•如果是磷酸化特異性抗體，封閉液和抗體稀釋液中需分別加 0.01% (v/v) 磷酸酶抑制劑混合物 A 和 B (sc-45044 and sc-45045)。
•將封閉好的膜置于用 Blotto 稀釋的一抗中室溫下孵育 1 小時(shí)。（磷酸化特異性抗體: Blotto B 中加入 0.01% (v/v) 磷酸酶抑制劑Cocktails A 和 B (sc-45044 和 sc-45045）。事先應(yīng)做一個(gè)抗體滴度以便找出最佳的抗體濃度。我們建議的起始稀釋濃度是 0.5-2.0 µg/ml。用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 分鐘。
•將膜置于用 Blotto 1:500-1:2000 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（常規(guī)免疫印跡二抗）中室溫孵育 45 分鐘。如果出現(xiàn)背景偏黑，二抗應(yīng)該進(jìn)一步稀釋（可達(dá)1：20,000）。如果電泳時(shí)用了 Cruz Marker™ 標(biāo)準(zhǔn)分子量（sc-2035），必需用Cruz Marker™ 匹配的二抗，以便能用 ECL 顯示標(biāo)準(zhǔn)分子量。
•TBST 洗膜 3 次，每次 5 分鐘，TBS（緩沖液和常規(guī)液體）。
•將膜與化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光氨（sc-2048）一起孵育，請(qǐng)參考發(fā)光氨說明書�；蛴玫鞍罪@色的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法。如果用發(fā)光氨顯示，必需用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗。、
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