細胞凍存好了，接下來要注意什么問題呢?沒錯，就是記得到時間了，拿出來復蘇。那么，細胞復蘇的過程中又有哪些該注意的事項呢?細胞活力和形態(tài)檢查的作用何在?不羅嗦了，請看下文：
活力檢查 – 千萬不要使用不健康的細胞，可能有污染(真菌、支原體等)，如果發(fā)現(xiàn)有污染毫不猶豫的丟棄!
形態(tài)檢查 – 檢查細胞的固有形態(tài)和生長行為。
好了，開始切入正題
凍存細胞：
補充新的培養(yǎng)液 – 在您開始凍存細胞的前一天補充新的培養(yǎng)液。
在細胞長至70%單層時收獲細胞，計數(shù)活細胞數(shù)，用凍存液調整細胞密度 ~5 x106 cells/ml (根據不同的細胞類型調整)
凍存液 – 用凍存液洗細胞并用凍存液重懸細胞，有不同類型的凍存液，根據細胞類型選擇最合適的凍存液(常用的凍存液成分有):
– 5-10% DMSO – 注意確保DMSO不含有其他的毒性物質.
– 5-15% 甘油
– 如果細胞在無血清培養(yǎng)基內生長，應在50%條件培養(yǎng)基內(細胞在無血清培養(yǎng)基內生長24小時)內凍存和復蘇。
在凍存管上標記好細胞類型，日期，凍存人等信息，并保證每凍存管不超過1.5ml.
程序降溫是保證凍存細胞活性的關鍵，使用 Mr. Frosty(找生物注一種裝置)保證降溫速度為1°-3°C，置于-80°C冰箱內過夜，如果沒有Mr. Frosty裝置，可以使用實驗室常見的泡沫盒、棉花等(原文是實驗室尿布，呵呵，不知道是什么鳥).
放入液氮罐之前記錄凍存管的數(shù)量和位置。以最快的速度轉移凍存管知液氮罐內，因此，此步驟最好使用干冰，或者把凍存管浸入裝有液氮的小盒內。此外還要注意，在凍存管上沒有足夠的空間記錄細胞的詳細信息，做好記錄是非常非常重要的!
還有一個最重要的，一定要在異地的液氮罐內保存同樣的一份細胞，以免其中的一個液氮罐出現(xiàn)問題!
細胞復蘇-正確的復蘇方式和正確的凍存方式同樣重要，熟記以下要點：
當從液氮罐內取出細胞時，有可能會出現(xiàn)凍存管破裂的情況，使用保護面罩和防護服十分必要(找生物注國內這個方面做得非常不好吧)
從液氮內轉移凍存管至熱的(溫度高的)容器內，應在液氮內完成(?)
應該與37℃水浴中快速溶解凍存的細胞，并保證凍存管蓋子在水面之上以避免污染。當最小的冰塊溶解后，用70%酒精擦拭凍存管，并迅速轉移至新的已經預熱的培養(yǎng)基內。
觀察細胞生長形態(tài)和生長比率。
其實，細胞復蘇只是一個簡單的實驗，不過這其中卻不可避免有一些需要注意的細節(jié)，不然，也不一定會盡如人意。例如說，人身健康方面：一定要記得做好防凍工作，戴上護目鏡;盡量降低DMSO對細胞的損傷等等。
原創(chuàng)作者：上海恒遠生物科技有限公司
