閱讀次數(shù)：1664 發(fā)布時間：2015/1/12 11:45:03
在微量板ELISA中，根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。下面我們簡單介紹這幾種Elisa實(shí)驗(yàn)的材料準(zhǔn)備及操作方法：
1. 間接ELISA
本法主要用于檢測抗體。以鴨病毒性肝炎（DVH）抗體的ELISA為例，間接ELISA的操作程序如下：
(1) 材料
① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液；
② DVH包被抗原、酶標(biāo)抗抗體、陰性及陽性DVH參考血清；待檢鴨血清；
③ ELISA檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步驟
① 加抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
③ 加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值，并計(jì)算出P/N比值。
(3) 結(jié)果判定
已知陽性血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知陽性血清的OD值≥0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待檢血清的OD值≥0.4，則判為陽性，否則判為陰性。
2. 雙抗體夾心ELISA
本法主要用于檢測大分子抗原。現(xiàn)以檢測雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。
① 加抗體包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 15分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值。
3. 雙夾心ELISA
此法與雙抗體夾心ELISA的主要區(qū)別在于：它是采用酶標(biāo)抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標(biāo)記每一種抗體，還可提高試驗(yàn)的敏感性。此法的基本程序?yàn)椋?/span>
① 加抗體（Ab-1）包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原（Ag） → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加用非同種動物生產(chǎn)的特異性抗體（Ab-2）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加入酶標(biāo)抗Ab-2抗體（AB-3）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑥ 用ELISA檢測儀測定OD值。
4. 競爭ELISA
此法主要用于測定小分子抗原及半抗原，其原理類似于放射免疫測定。其基本程序?yàn)椋?/span>
① 抗體包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原（對照孔僅加酶標(biāo)抗原）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
④ 用ELISA檢測儀測定OD值。
被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少，這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測；其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標(biāo)記，而且因?yàn)榭乖慕Y(jié)構(gòu)不同，還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此外，試驗(yàn)中應(yīng)用酶標(biāo)抗原的量較多。
5. 阻斷ELISA
本法主要用于檢測型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬�。�PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測法為例介紹其操作程序：
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 用200μl阻斷緩沖液進(jìn)行封閉 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑦ 用ELISA檢測儀測定OD值。
本試驗(yàn)同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清對照、兔抗AP2型陽性對照、空白對照。
6. 抗體捕捉ELISA
本法主要用于檢測IgM抗體。由于IgM抗體出現(xiàn)于感染早期，所以檢測出IgM，則可作為某種疾病的早期診斷。抗體捕捉ELISA根據(jù)所用標(biāo)記方式不同可分為標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗體、標(biāo)記抗抗體捕捉ELISA等幾種，其中以標(biāo)記抗原捕捉ELISA比較有代表性，該方法的主要程序?yàn)椋?/span>
① 用抗u鏈（抗IgM重鏈）抗體包被→37℃ 60分鐘后置4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
③ 加酶標(biāo)抗原 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值。
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